晶欣 重組人纖粘連蛋白片段 轉(zhuǎn)染 *   產(chǎn)品貨號：GX100B 

儲存條件：-20℃

產(chǎn)品組分：重組人纖粘連蛋白 2.5mg，該試劑以1 mg/ml 溶液形式提供。【含有12.5 mM檸檬酸鈉(pH 6.2)和1.25%蔗糖的無菌溶液?！?/span>

產(chǎn)品介紹：

該重組人纖維連接片段（rFN-CH-296），由三個功能結(jié)構(gòu)域組成：細胞結(jié)合域 、肝磷脂結(jié)合域和CS1位點。該片段通過協(xié)助靶細胞和病毒粒子的共定位來增強逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)導。其作用原理是：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與肝磷脂結(jié)合域結(jié)合，細胞表面VLA-5及 VLA-4分別與該纖連蛋白的細胞結(jié)合域 和 CS-1位點結(jié)合。

在經(jīng)重組人纖粘連蛋白片段包被的培養(yǎng)容器表面，細胞與病毒載體高濃度共存，從而提高基因感染效率。

感染方案：

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒與該重組人纖粘連蛋白片段包被的培養(yǎng)板結(jié)合，去除逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液后加入靶細胞。但去除上清液會減少抑制性分子(例如，從生產(chǎn)細胞分泌的分子，如蛋白聚糖、病毒包膜蛋白)，從而降低病毒介導的基因轉(zhuǎn)導效率。

2.細胞與病毒上清液混合并結(jié)合到重組人纖粘連蛋白片段包被的培養(yǎng)板上。

兩種方案均可用于有效的基因轉(zhuǎn)導。盡管方案1廣泛適用，但具體實驗方案可能仍需根據(jù)靶細胞、載體、靶基因進行修改。

晶欣 重組人纖粘連蛋白片段 轉(zhuǎn)染 *   產(chǎn)品貨號：GX100B 

實驗方案：

1. 重組人纖粘連蛋白片段包被培養(yǎng)板的制備

將重組人纖粘連蛋白片段包被于培養(yǎng)板上，濃度20-100μg/ml的重組人纖粘連蛋白片段可達到4-20μg/cm²的包被密度。

（1）包被前，用無菌PBS將該溶液稀釋至20-100μg/ml?！菊?zhí)崆坝嬎阒亟M人纖粘連蛋白試劑的用量，如：2.25ml濃度為20μg/ml的重組人纖粘連蛋白溶液放入直徑為35mm的培養(yǎng)皿（9cm²）中時，用于包被的密度為5μg/cm²】

注意：為避免重組人纖粘連蛋白片段丟失，請勿將PBS稀釋的重組人纖粘連蛋白溶液過濾除菌。

（2）將適當體積（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml。）的無菌重組人纖粘連蛋白溶液分配到每個板中，讓板在室溫下靜置2小時或在4℃過夜。

注意:在此步驟中應(yīng)使用未經(jīng)處理的細胞培養(yǎng)級組織培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。

（3）移除重組人纖粘連蛋白溶液，然后用適量含無菌2%牛血清白蛋白(BSA，Fraction V)的PBS溶液進行封閉（24孔板中每孔0.5 ml，或6孔板每孔2 ml），讓板在室溫下靜置30分鐘。

（4）移除BSA溶液，用適當體積的HBSS/Hepes或PBS清洗一次。除去洗滌液后，即可使用。重組人纖粘連蛋白片段包被板可用封板膜密封，并在4℃下儲存—周。

2.基因轉(zhuǎn)導

使用重組人纖粘連蛋白試劑進行基因轉(zhuǎn)導的方法有兩種:重組人纖粘連蛋白結(jié)合病毒感染法(A方法)和上清液感染法(B方法)。在A方法中，逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒首先結(jié)合到涂有重組人纖粘連蛋白試劑的板上，去除病毒上清液后加入靶細胞。在B方法中，將病毒溶液和靶細胞混合，然后添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中。

如果病毒溶液未經(jīng)純化直接用于病毒感染，可能會因為污染導致基因轉(zhuǎn)導效率降低。在這種情況下，推薦使用A方法，通過將病毒與重組人纖粘連蛋白試劑結(jié)合并去除上清液來去除抑制物。

A.重組人纖粘連蛋白結(jié)合病毒感染方法

A-1.病毒結(jié)合板制備（無需離心）

1.將125- 250μl/cm2的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液添加到涂有重組人纖粘連蛋白的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中。

2.在5% CO2培養(yǎng)箱中 32℃或37℃孵育4至6小時，使病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白試劑充分結(jié)合。

3.棄上清液，但不要讓培板干燥。用適當體積的 PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的 PBS清洗，清洗后按A-3進行感染。

A-2.離心法制備病毒結(jié)合板

如果病毒滴度足夠高，則病毒與重組人纖粘連蛋白試劑的結(jié)合無需離心即可完成，如A-1中所述。

但如果滴度較低，或者您需要更高的基因轉(zhuǎn)導效率，則最好通過離心結(jié)合病毒。使用這種方法，結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒所需的時間顯著減少(離心法2小時，非離心法4-6小時)。一塊未經(jīng)處理的細胞培養(yǎng)板，在32℃下可以承受1,000-2,000g離心2小時。此外，請注意有可能形成氣溶膠。

1.將125-500μl/cm²的逆轉(zhuǎn)錄病毒原液或稀釋溶液添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中。

2.將板置于預(yù)熱至32℃的離心機中，并在32℃ 1,000-2,000g 下離心2小時，以使病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白試劑充分結(jié)合。

3.棄上清液，但不要讓板干燥。用適當體積的PBS或含有0.1-2%白蛋白(BSA或HSA)的PBS清洗，然后按照A-3進行病毒感染。

A-3.病毒感染

在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒與重組人纖粘連蛋白片段包被板結(jié)合時準備靶細胞。靶細胞處于對數(shù)生長期并表達整合素受體VLA-4和/或VLA-5至關(guān)重要。當使用造血干細胞時，可能需要用細胞因子進行預(yù)刺激，細胞因子類型應(yīng)根據(jù)您的具體研究方案確定。

1.收集目標細胞并計算活細胞的數(shù)量，然后以細胞濃度0.2-1x105/ml將細胞懸浮在生長培養(yǎng)基中。

2.從A-1或A-2制備的病毒結(jié)合板中去除洗滌液。不要讓板干燥。立即加入密度為0.5-2.5x 104/cm2的靶細胞。雖然最佳細胞密度取決于細胞大小和生長速率，但初始細胞密度還是應(yīng)使細胞轉(zhuǎn)導后2-3天分析時能夠積極生長或接近匯合。當感染更多細胞時，可能會增加細胞密度，但細胞在基因轉(zhuǎn)導后需要傳代培養(yǎng)。 

3.在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2-3天。

4.收集非貼壁和貼壁細胞:

（1）將上清液轉(zhuǎn)移到離心管中。

（2）用PBS洗滌培養(yǎng)板，收集剩余的非貼壁細胞。

（3）分離貼壁細胞。

（4）將步驟(1)-(3）中獲得的細胞混合在同一管中，離心回收細胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗滌細胞兩次，并通過離心收集。如果還需進行進一步分析，可將細胞在HBSS/Hepes溶液重懸（適用于細胞下游應(yīng)用的任何緩沖液或培養(yǎng)基也可用于重懸）。

B.上清液感染方法

使用病毒原液時，推薦A方法，但如果稀釋4倍及以上，A、B方法都可以用，因為可獲得等效的基因轉(zhuǎn)導效率。此外，B方法感染病毒所需的時間比A方法短很多。

1.將靶細胞懸浮在已用生長培養(yǎng)基稀釋的病毒溶液中以制備細胞懸液。

2.將細胞懸液添加到重組人纖粘連蛋白片段包被板中，細胞密度為0.5-25×10⁴/cm²。雖然最佳細胞密度取決于細胞大小和生長速率，但在轉(zhuǎn)導后2-3天分析基因表達時，初始細胞密度應(yīng)允許細胞積極生長或接近匯合。當感染更多細胞時，可能會增加細胞密度，但細胞在基因轉(zhuǎn)導后需要傳代培養(yǎng)。

3.在37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天。

4.收集非貼壁和貼壁細胞:

（1）將上清液轉(zhuǎn)移到離心管中。

（2）用PBS洗滌培養(yǎng)板，收集剩余的非貼壁細胞。

（3）分離貼壁細胞。

（4）將步驟(1)-(3）中獲得的細胞混合在同一管中，離心回收細胞。

（5）用HBSS/Hepes溶液洗滌細胞兩次，并通過離心收集。如果還需進行進一步分析，可將細胞在HBSS/Hepes溶液重懸（適用于細胞下游應(yīng)用的任何緩沖液或培養(yǎng)基也可用于重懸）。

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